糖尿病是一种以慢性高血糖症为特征的代谢紊乱和代谢异常的疾病，糖尿病患者骨质疏松的机制尚不清楚。在这里，我们研究来自高血糖（2型糖尿病，T2D）和正常血糖小鼠的骨髓基质细胞（BMSCs）代谢组学的差异。来自T2D小鼠的BMSCs中，基本上有一百四十四种代谢物被调节，而三羧酸（TCA）循环是高血糖受损的主要代谢途径之一。重要的是，来自T2D小鼠的BMSCs中，TCA循环中的中间体代谢物琥珀酸酯增加了24倍。琥珀酸作为细胞外配体通过与破骨细胞谱系细胞上的特异性受体结合并在体外和体内刺激破骨细胞发生而起作用。靶向受体活化的机制抑制破骨细胞发生。该研究揭示代谢物介导的破骨细胞发生，有助于揭示代谢紊乱中骨质疏松的调节机制。
一种脆性症已经成为糖尿病的并发症，糖尿病是以代谢物异常调节的慢性高血糖为特征的代谢性疾病。T2D与小梁缺损有关，骨的皮质多孔性增加。然而，糖尿病和骨代谢受损的病理生理机制尚不清楚。在细胞效应方面，是否存在由高血糖引起的异常代谢物和骨维持中细胞功能受损之间的直接和原因之间的联系。虽然T2D患者通常维持小梁骨密度，但在T2D患者中观察到皮层孔隙率增加，这表明OC活动和骨丢失增加。总体而言，T2D患者表现出增加的成骨细胞凋亡，成骨细胞分化减少和OC介导的骨吸收增强。糖尿病的动物模型都显示增强的破骨细胞形成和骨吸收。高葡萄糖浓度在体外抑制RANKL诱导的破骨细胞发生。因此，糖尿病动物模型中增强的OC活性可能不是高血糖的直接后果。我们报道了来自骨髓器官水平的糖尿病小鼠的重大代谢组学改变。我们发现琥珀酸盐是三羧酸（TCA）循环中的中间体代谢物，在糖尿病小鼠的骨髓中异常累积，这反映了以前关于增殖性糖尿病视网膜病变患者琥珀酸增加的报道。琥珀酸盐通过琥珀酰CoA连接酶在TCA循环中由琥珀酰辅酶A产生。除了其作为TCA循环中的代谢物的传统功能之外，琥珀酸还通过激活琥珀酸受体1（SUCNR1，一种G蛋白偶联受体）具有类激素样功能。SUCNR1在小鼠肾脏，肝脏，脾脏和小肠中高度表达。高血糖导致链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠视网膜神经节细胞中琥珀酸积累和SUCNR1活化。琥珀酸激活的SUCNR1以缺氧诱导因子-1α（HIF-1a）的独立方式诱导促炎细胞因子的表达。具体来说，SUCNR1的琥珀酸刺激能够使树突状细胞介导的T细胞活化，其能够诱导破骨细胞发生。因此，我们假设升高的琥珀酸可以通过SUCNR1激活增强破骨细胞发生和骨丢失。
在本研究中，分别使用friendvirusB(FVB)野生型（WT）和MCK-KR-hIGF-IR（MKR）转基因小鼠作为正常和高血糖模型。由于干扰肌肉中葡萄糖摄取的人IGFI受体的显性阴性突变体的组织特异性表达，使用体内和体外模型，我们的研究揭示了来自T2D小鼠的骨髓基质细胞（BMSCs）中代谢物变化的变化，并通过SUCNR1表达基质细胞衍生的琥珀酸酯的功能，并刺激NF-kB信号传导以增强破骨细胞发生。
1.高血糖症状异常琥珀酸积累2.琥珀酸刺激破骨细胞发生和骨吸收3.靶向琥珀酸信号阻碍破骨细胞发生4.琥珀酸通过NF-κB信号调节破骨细胞发生
1.高血糖症状异常琥珀酸积累
最近，我们报道了糖尿病小鼠骨髓中改变的代谢组学和低效呼吸活性，通过器官水平的TCA循环中许多代谢物的不平衡来证明。为了剖析高血糖对细胞水平上骨代谢的具体影响，我们采用相同的代谢组学方法，利用液相色谱-质谱（来自正常（WT）和高血糖（MKR）雄性小鼠的BMSC样品中的代谢物谱LC-MS）代谢组学（图1a，b）。
（a）来自WT和MKR小鼠培养的BMSCs的种代谢物的聚类散点图。每个圆圈代表四个生物样品中的一个的三个技术重复之一。聚类使用SIMCA中的PLS-DA模型和单位方差缩放（Umetrics，Sweden）。R2Y?0.。Q2?0.。椭圆表示95％置信区间。（b）在本研究中检测到的仅代表TCA循环代谢产物（KEGG通路）的代谢物对聚类的贡献的散点图显示出来。每个绿色圆圈代表一种代谢物;每个蓝色圆圈表示每个样品组的参考点。该图是在SIMCA中生成的，并在AdobeIllustrator中格式化。
根据隔夜禁食后的葡萄糖耐量试验，雄性MKR小鼠在12周龄时变得严重的糖尿病（补充图1a）。我们从正模式提取了14,个质量特征（每个由一对保留时间和精确质量定义），并且从负模式提取了5,个质量特征。原始数据已存入代谢组学数据库和协调中心。与WTBMSCs相比，MKRBMSCs中种代谢物明显改变了41.5倍;个被上调，16个被下调（补充表1）。由于琥珀酸是TCA循环中第一个代谢产物，由于糖尿病而在骨髓间充质干细胞中表现出异常积累，因此它可能是对高血糖反应的关键代谢因子。与WT小鼠几乎检测不到的血清琥珀酸水平相反，MKR小鼠的血清琥珀酸水平显着升高20倍以上（图1c）。
当小鼠变成糖尿病时，6-8周龄的MKR小鼠的琥珀酸水平开始上升，当MKR小鼠达到12周龄时，琥珀酸水平变得显着（补充图1b，c）。
综合以上事实，在总骨髓抽吸物中观察到琥珀酸水平的异常积累，T2D小鼠在细胞外和细胞内均无法控制全身和局部水平的琥珀酸。重要的是，高葡萄糖培养显著升高人骨髓基质干细胞中的琥珀酸水平（图1d）。
琥珀酸酯在TCA循环中被琥珀酸脱氢酶（SDH）转化为富马酸，SDH活性不足可导致琥珀酸酯积累到在线粒体，胞质溶胶中，最终在细胞外环境中的积累。我们观察到SDH活性在人和小鼠骨髓基质干细胞中的高葡萄糖水平显着降低（图1e，f），这可以解释琥珀酸盐在骨髓中的异常积累。
同时，根据微计算机断层扫描（mCT）分析，MKR小鼠骨小梁骨量减少（图1g，h）。基于TRAP染色（图1i，j），每只骨表面的OC表面在MTR小鼠中比WT小鼠更大。血清骨吸收标记物TRAP5b水平升高也反映了OC活性升高（图1k）。琥珀酸升高和MKR小鼠受损骨表型的一致，表明琥珀酸盐在骨代谢中的调节作用。然而，尚不清楚高琥珀酸与糖尿病相关的骨损伤之间是否存在因果关系。
与以前的报告一致，MKR小鼠是比老年配对的WT小鼠体重减轻的瘦的糖尿病模型（图11）。
2.琥珀酸刺激破骨细胞发生和骨吸收
在RANKL和M-CSF（图2）和RAW.7细胞存在下，在RANKL存在下，琥珀酸的施用显着增加了骨髓细胞培养物中的OC数（图2B，S2a，b）基于TRAP染色。在过去3天（D4-6）或从培养开始（D0-6）加入时，琥珀酸酯增加骨髓细胞培养物中的OC数。暴露于琥珀酸酯的OC培养时间更长，表现出更多的OC（图2a，b）。
琥珀酸盐还以剂量依赖性方式增强了OC分化（图2c，d），并将吸收凹坑的面积增加了三倍（图2e，f），而不影响前体细胞中的细胞增殖（补充图2c）。
琥珀酸盐刺激OC分化和成熟的标志物基因的表达，包括活化的T细胞的核因子(NFATc1），TRAP，组织蛋白酶K（Ctsk）和降钙素受体（CalR）（图2g），这进一步支持细胞外琥珀酸在体外刺激破骨细胞发生的断言。
为了评估琥珀酸盐在体内刺激OC的功效，将WTFVB小鼠注射琥珀酸（图3）。琥珀酸盐每日注射7周导致血清琥珀酸水平显着升高（图3a）和显着的骨丢失（图3b-g）。
前体OC群体不受琥珀酸调节（图3h）
琥珀酸盐给药，每个骨表面的成熟OCs的表面（图3i，j）增加。
除直接刺激破骨细胞形成外，琥珀酸盐摄入可下调血清白介素（IL）-4和IL-13水平（图3k）和上调的成骨细胞因子肿瘤坏死因子（TNF）和IL-1b水平（图31，m）。
用琥珀酸注射2周的小鼠表现出OC数量和活性增加的趋势（补充图3），随着时间的推移，需要累积支持琥珀酸的作用。
在WTC57/B6小鼠（补充图4）中也证实了琥珀酸盐注射对骨吸收的功效，其中12周龄雄性小鼠接受琥珀酸注射6周。与FVB小鼠中的琥珀酸作用一致，根据mCT分析，用琥珀酸处理的C57/B6小鼠表现出骨矿物质密度，骨量，骨小梁数目减少和骨小梁分离度增加（补充图4a-f）。同时，琥珀酸提高血清吸收标记TRAP5b水平（补充图4g）和TNF和IL-1b水平（补充图4h，i）。
琥珀酸给药不改变小鼠的体重（图3n和补充图4j）。
3.靶向琥珀酸信号阻碍破骨细胞发生
我们检查了各种骨细胞中琥珀酸特异性受体SUCNR1的表达。SUCNR1在造血谱系细胞中表现出独特的表达（图4a）。在MKR小鼠中表现出升高的细胞内琥珀酸水平的BMSC和成骨细胞谱系细胞（Pre-OB和OB）中，SUCNR1的表达是不可检测的。相比之下，SUCNR1在造血系细胞如成熟鼠OC及其前体细胞（BM骨髓细胞;髓细胞）中高度表达。该结果表明琥珀酸作用是非自主模式（即基质细胞通过SUCNR1在骨中的造血谱系细胞的表达上发挥琥珀酸的功能）。
为了确定琥珀酸酯和SUCNR1在OC中的作用，我们合成了特异性SUCNR1拮抗剂4c，以抑制琥珀酸的SUCNR1活化。我们使用核磁共振光谱证实合成化合物的结构（补充图5a和高效液相色谱显示该化合物的纯度为98.％（补充图5b），
4c在培养物中浓度0.1,1,10，50mM并测试了来自ficoll加工的小鼠骨髓细胞的OC，并且4c开始减少0.1mM的琥珀酸的刺激，在1mM时，能够完全消除琥珀酸酯模拟的体外破骨细胞发生（图4b，c），在较高浓度（50mM）下，4c抑制了对照组和琥珀酸处理组（图4b，c）的破骨细胞形成，表明高剂量下4c的毒性作用，但高达mM的4c没有抑制作用对破骨细胞的生存能力的影响（补充图5c）
我们进一步用siRNA在体外敲除SUCNR1，尽管用Lipofactamine-进行的转染负面影响细胞附着，留下更少的细胞数，与对照治疗组相比，琥珀酸盐治疗仍然增加了TRAP阳性细胞的数量。用50nM的siRNA敲低SUCNR1，使琥珀酸盐刺激破骨细胞发生（补充图5d，e）。
通过来自WT和SUCNR1敲除（KO）小鼠的OC的实验，SUCNR1对OC中琥珀酸酯效应的依赖性得到了明确的支持。在SUCNR1KO小鼠的骨髓OC中消除琥珀酸增强的破骨细胞发生（图4d，e）。这些结果共同表明琥珀酸增强的破骨细胞发生需要SUCNR1。
我们观察到二甲双胍重新设定糖尿病小鼠骨髓中代谢物平衡的变化。此外，二甲双胍治疗显着降低了来自MKR小鼠的BMSCs和血清中的琥珀酸高度（图5a，b和补充表2）。二甲双胍治疗在MKR骨髓基质干细胞中调节81种代谢物;14种代谢物上调，67种代谢物下调（补充表2）。
有研究已经证实二甲双胍在体外减少破骨细胞发生，但是还不清楚它是否还能降低体内破骨细胞发生，特别是在T2D中。我们证实，二甲双胍在衍生自二甲双胍治疗的MKR小鼠的骨髓的OC培养物中显着减少体外OC（图5c，d）和骨吸收活性（图5e，f）。
二甲双胍减少体内TRAP阳性（TRAP+）细胞所表现的每个骨表面的OC表面（图5g，h），其对骨量有保护作用因为每天接受二甲双胍的MKR小鼠骨小梁面积更大14天（图5i）。
此外，通过mCT分析（图5j-p）证实了二甲双胍对保存MKR小鼠骨量的保护作用，而不改变小鼠的生长（图5q）。在7和14天后，二甲双胍开始降低MKR小鼠的血糖水平（图5r），这减轻了MKR小鼠高血糖症的严重程度。
4.琥珀酸通过NF-κB信号调节破骨细胞发生。
二甲双胍降低琥珀酸水平可能有助于二甲双胍在保护糖尿病骨损伤方面的有益效果。我们调查是否添加琥珀酸可以在来自二甲双胍治疗的小鼠的OC细胞中拯救破骨细胞发生。实际上，衍生自用二甲双胍治疗2周的MKR小鼠的OC培养物产生的多核TRAP阳性OC细胞减少了20％;在体外添加琥珀酸能够将OC的数量恢复到与对照培养物相同的水平（图6a，b）。体内二甲双胍对来自WT小鼠的破骨细胞发生的影响最小，其中观察到低琥珀酸水平。该结果支持二甲双胍抑制破骨细胞发生的作用可能通过拮抗高血糖诱导的琥珀酸盐升高而起作用。
通过p65-p50异二聚体核定位的核定位介导的经典NF-kB信号传导在RANKL诱导的破骨细胞发生中起重要作用。琥珀酸盐给药也上调了来自OC细胞的核蛋白裂解液中p65和p50的水平（图6c），SUCNR1是琥珀酸盐刺激NF-κB信号传导所必需的。二甲双胍与对照细胞相比中度降低p50水平，而且显著降低了琥珀酸对p50和p65的刺激（图6c）。
与来自WT小鼠骨髓的OC相反，琥珀酸酯不能刺激来自SUCNR1KO小鼠骨髓的OC中p65和p50的核定位（图6d和补充图6a）。
类似地，琥珀酸增强的RANKL诱导的RAW.7细胞中的NF-κB增加（补充图6b）。与琥珀酸盐或二甲双胍治疗无关，替代NF-κB通路蛋白RelB的表达保持稳定（补充图6c）。这些研究结果表明，琥珀酸和二甲双胍在经典的NF-kB信号通路上相互衔接
调节破骨细胞发生。如图7所示，我们的研究结果表明糖代谢增强骨退化的分子途径。
来自T2D模型的高血糖的骨骼由于BMSCs中SDH（琥珀酸脱氢酶）缺乏引起的琥珀酸积累。琥珀酸通过激活SUCNR1和NF-κB信号传导促进OC分化和骨吸收。琥珀酸作用的抑制-通过二甲双胍降低配体水平或通过SUCNR1拮抗剂4c靶向受体，用siRNA敲除或敲低，有效抑制琥珀酸增强的破骨细胞形成和高血糖病症中的骨丢失。
琥珀酸盐可以通过刺激破骨细胞发生来增强骨丢失，而不增加OC前体细胞。SUCNR1似乎对于琥珀酸刺激破骨细胞的发生是至关重要的。
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"这一发现的重要性在于，糖尿病患者具有更高的骨折的风险，而愈合的过程相比之下则慢得多"，该文章的通讯作者，来自纽约大学的副教授XinLi说道："在我们的研究中，糖尿病小鼠具有更高的骨质吸收的速率，而其骨细胞新生的速率则较低。这一发现对于骨骼的保护，以及糖尿病引发的骨骼损伤的治疗都具有重要的意义"。
Li博士的这项研究第一次揭示了高血糖小鼠中，琥珀酸盐在骨髓以及血清中的累积。这对于调节琥珀酸盐来保护糖尿病患者的骨质健康提供了新的思路。
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