JCIInsight（if8.）
Mitochondria-dependentferroptosisplaysapivotalroleindoxorubicincardiotoxicity
背景介绍
阿霉素(DOX)是一种化疗药物，可引起心脏毒性，导致进行性、慢性、危及生命的心肌病，称为DOX诱导的心肌病(DIC)。DIC是一种致命性心肌病，与其他心肌病相比预后更差，并且由于其心脏毒性限制了DOX在恶性肿瘤中的应用。铁死亡是一种铁依赖的调节性细胞死亡(RCD)，可以通过铁螯合来预防，目前被认为是RCD的一种形式，它是致命的脂质氧化的结果。因此，用作亲脂性自由基捕获抗氧化剂(RTA)的铁抑素-1(Fer-1)可以预防铁死亡。Gpx4是脂质过氧化物(LPs)的内源性清除剂，是铁死亡的关键调节因子。有证据表明，大多数铁死亡诱导剂是Gpx4的直接或间接抑制剂，许多铁死亡抑制剂是脂质过氧化的抑制剂，如RTAs。
研究结果
1.Gpx4的下调和LPs的增加会导致DIC小鼠的心脏损伤。
图1.
2.Gpx4是DIC发生发展过程中的重要调控因子。图2.
图3.
3.铁死亡与DOX诱导培养的心肌细胞死亡有关。图4.
4.DOX诱导的铁死亡在线粒体中被触发。图5。
图6.
5.线粒体中与亚铁离子(Fe2+)的螯合作用，而不是与铁离子(Fe3+)的螯合作用，可以防止DOX诱导的脂多糖(LPs)和铁死亡。图7.
考虑到铁在Fenton反应中作为脂多糖来源的作用，DOX处理下的铁的动力学可能与生理条件下的不同，因为DOX本身是Fe3+的螯合剂，并形成DOX-Fe3+络合物。DOX-Fe3+以氧浓度依赖的方式被还原为DOX-Fe2+络合物，然后它产生羟基自由基(OH-)，导致LPs的产生，这表明DOX-Fe2+而不是游离Fe2+在DOX相关LP的产生中起核心作用。此外，DOX可以直接从铁蛋白(29)中提取Fe3+，这表明DOX在没有游离Fe3+的情况下形成DOX-Fe3+络合物，在DOX处理下，游离Fe2+和Fe3+可能不是DOX-Fe络合物形成和LP产生所必需的。事实上，先前报道使用邻菲咯啉(BPS)螯合Fe2+可以通过抑制DOX-Fe2+有效地阻止DOX诱导的LPs。因此，我们假设与Fe2+的螯合可以防止DOX诱导的脂蛋白和铁死亡。为了研究螯合剂对抗Fe2+在DOX诱导的铁死亡中的作用，使用线粒体特异性Fe2+荧光指示剂Mito-FerroGreen(MFG)作为线粒体中Fe2+的螯合剂。这项检查显示，MFG处理显著阻止了DOX诱导的脂多糖和细胞死亡(图7，G-I)，表明DOX-Fe2+在线粒体中产生脂多糖，并诱导线粒体依赖性铁死亡。这些结果表明，DOX-Fe2+在DOX相关的Fenton反应中起中心作用，线粒体上针对Fe2+的螯合剂(而不是Fe3+)能有效地阻止DOX诱导的脂多糖和线粒体依赖性铁死亡。
铁死亡是DOX治疗后心肌细胞RCDS的主要形式。Fer-1、Ad-cellGPx4或Ad-mitoGPx4对铁死亡的抑制作用不能完全消除DOX诱导的细胞死亡。另一方面，在DOX诱导的心肌细胞中，caspases的裂解显著增加(图6A)，表明凋亡也是DOX诱导的细胞死亡中RCD的一种重要形式。此外，Zhang等报道称，坏死也是DOX诱导细胞死亡的另一种形式的RCD。然而，用Necrostatin-1抑制RIP1K或敲除RIPK3对DOX诱导的细胞死亡没有显著的保护作用，而RIPK3敲除抑制了DOX诱导的caspase裂解，这表明在DOX治疗下，通过RIP3K的坏死是RCD的一种相对较小的形式，可能被认为是凋亡的一部分。表明DOX诱导的RCDS主要是细胞凋亡和铁死亡。为了阐明铁死亡与细胞凋亡的独立性，作者观察了Fer-1与凋亡抑制剂ZVAD-FMK(ZVAD)联合应用对DOX诱导的细胞死亡的影响。ZVAD处理可完全抑制DOX诱导的caspase裂解和caspase活性，而Fer-1则不能(图8，A和B)。此外，在DOX处理下，Fer-1没有减少胞浆中的细胞色素c，它代表线粒体依赖的凋亡(图8C)，以及用AnnexinV结合标记的凋亡细胞的数量(图8D)。另一方面，Fer-1显著抑制了线粒体LP对DOX的反应，而ZVAD则没有(图8e)。这些结果表明，在DOX诱导的细胞死亡过程中，铁死亡的诱导不依赖于细胞凋亡。
图8.
为了探讨铁死亡在DOX诱导的心脏毒性和细胞凋亡中的意义，作者进一步检测了DOX处理后Gpx4和裂解caspases的时程，发现裂解caspases在DOX处理后10小时达到高峰，而Gpx4在DOX处理后30小时才逐渐下调(图9A)。作者还检测了Fer-1和/或ZVAD在每个时间点对DOX诱导的细胞死亡的影响，发现ZVAD或Fer-1部分阻止了DOX诱导的细胞死亡，而Fer-1和ZVAD同时抑制铁死亡和细胞凋亡在任何时间点都完全阻止了DOX诱导的细胞死亡(图9B)。这些结果表明铁死亡和细胞凋亡协同作用诱导DOX诱导的细胞死亡。根据图9B所示的数据，图9C总结了DOX诱导细胞死亡的机制，表明铁死亡和细胞凋亡是DOX治疗后任何时相DOX诱导的心肌细胞死亡的主要RCD形式。
图9.
总结
在本文，作者表明DOX下调谷胱甘肽过氧化物酶4(Gpx4)，并通过DOX-Fe2+复合物诱导线粒体过度脂质过氧化，导致线粒体依赖性铁死亡；还表明线粒体依赖性铁死亡是DOX心脏毒性的主要原因。DIC小鼠第14天左心室射血分数明显受损，出现纤维化和TUNEL+细胞。此外，铁死亡的内源性调节因子Gpx4表达下调，并伴有脂质过氧化物的积聚，尤其是线粒体。这些心脏损伤在Gpx4TG小鼠中得到改善，在Gpx4异源缺失小鼠中加重。在培养的心肌细胞中，针对线粒体Fe2+的Gpx4过表达或铁螯合可阻止DOX诱导的铁死亡，表明DOX引发了线粒体的铁死亡。此外，铁抑素-1和zVAD-FMK同时抑制铁死亡和细胞凋亡，可完全阻止DOX诱导的心肌细胞死亡。研究结果表明，线粒体依赖性的铁死亡在DIC的进展中起着关键作用，在DOX心脏毒性中，铁死亡是调节细胞死亡的主要形式。
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